Canola with gene editing by the CIBUS RTDS (TM) system is not a GMO according to a German Agency.

AZ: 42050

Stellungnahme der ZKBS zu mittels RTDS (Rapid Trait Development System) hergestellten herbizidresistenten Rapslinien der Firma Cibus.

Rough translation: Opinion of ZKBS on using RTDS (Rapid Trait Development System) produced herbicide-resistant canola lines as proposed by the company CIBUS.
Occasion
The company Cibus Europe (Chapel, Netherlands) intends to perform field trials with (Brassica napus L) herbicide-resistant oilseed rape plants developed with the RTDS TM technique. The guidelines focus is performance testing and seed production for further investigations. Cibus company, asked the Federal Office of Consumer Protection and Food Safety (BVL) for an opinion, in which found that the means RTDSTM developed canola lines are not to be classified as GMOs within the meaning of the Genetic Engineering Act and the planned field trials therefore can be performed without the permit application required for GMOs .

(Reader comments providing  better English translation are welcome)

Anlass

Die Firma Cibus Europe (Kapelle, Niederlande) beabsichtigt, Feldversuche mit

herbizidresistenten Rapspflanzen (Brassica napus L) durchzuführen, die mittels der

sogenannten RTDSTM-Technik entwickelt wurden. Im Vordergrund stehen dabei

Leistungsprüfungen und die Saatgutproduktion für weitere Untersuchungen.

Firma Cibus hat das Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) um

eine Stellungnahme gebeten, in welcher festgestellt werden soll, dass die mittels RTDSTM

entwickelten Rapslinien nicht als GVO im Sinne des GenTG einzustufen sind und die

geplanten Feldversuche daher ohne den für GVO erforderlichen Genehmigungsantrag

durchgeführt werden können.

RTDSTM gehört zu den Neuen Techniken in der Pflanzenzüchtung, über deren regulatorischen

Status in der EU noch nicht abschließend entschieden wurde. Im Juni 2012 hat die ZKBS eine

Stellungnahme verfasst um zu klären, ob die aus den Neuen Techniken der Pflanzenzüchtung

resultierenden Organismen im Sinne der bestehenden Rechtsvorschriften gentechnisch

verändert sind. Vor diesem Hintergrund bittet das BVL die ZKBS um eine Bewertung der

RTDSTM-Technologie sowie eine Stellungnahme, ob die damit hergestellten Rapslinien

gentechnisch veränderte Organismen im Sinne des GenTG sind.

Die Firma Cibus hat auch bei den zuständigen Behörden des Vereinigten Königreichs,

Schwedens und Finnlands diesbezüglich Stellungnahmen eingeholt und diese vorgelegt.

Übereinstimmend stufen die o.g. Behörden die mittels RTDSTM-Technologie entwickelten

Rapslinien nicht als GVO ein.

Beschreibung der RTDSTM-Technologie

Die RTDSTM-Technologie erlaubt es, zielgerichtete Mutationen im Pflanzengenom

herbeizuführen. Dabei kommt es zum Austausch einzelner Nukleotide in den Zielgenen, ohne

dass die Fremd-DNA in das Pflanzengenom integriert wird. Bei der Anwendung der RTDSTM-

Technologie werden zelleigene DNA-Reparaturmechanismen ausgenutzt. Das

Schlüsselelement dieser Technologie ist ein chemisch synthetisiertes Oligonukleotid, das

sogenannte Gene Repair Oligonucleotide (GRON). Die Sequenz dieses Nukleotids ist, mit

Ausnahme von einem oder zwei Nukleotiden, komplementär zur der Zielsequenz im Genom

und führt zur ortsspezifischen Hybridisierung des GRONs mit der Ziel-DNA in der Zelle. Die im

GRON eingebauten, von der Zielsequenz abweichenden Nukleotide führen dabei zu einer

DNA-Fehlpaarung. Wird diese Fehlpaarung erkannt, so kommt es nach allgemeiner

Vorstellung zur Veränderung der Ziel-DNA, indem die fehlgepaarten Basen im Zielgen

ausgetauscht werden, wobei GRON als Template dient. Nach dem erfolgten Austausch wird

GRON abgebaut. Die Effektivität der Mutagenese hängt von der Struktur und Beschaffenheit

von GRON ab. GRON ist ein einzelsträngiges DNA-Molekül mit der Länge von ca. 40

Nukleotiden. Das 5 ́- und 3 ́-Ende ist mit dem fluorogenen Molekül CY3 bzw. mit einem Iso-

Deoxycytosin (idC) markiert/geschützt. Diese chemischen Modifikationen stabilisieren das

GRON-Molekül in der Zelle, in dem dessen Abbau durch Exonukleasen verzögert wird.

Dadurch wird es ermöglicht, dass die Hybridisierung und der Basentausch in der Zielsequenz

mit höherer Effektivität erfolgen (1; 2). Gleichzeitig verhindern diese Modifikationen vermutlich

die Interaktion von GRON mit den für die Rekombination notwendigen DNA-bindenden

Proteinen und Enzymen und damit die Integration von GRON in das Pflanzengenom. Trotz

seiner relativen Stabilität in der Zelle besitzt GRON nur eine kurze Halbwertszeit von ca. 30

min. Die hohe Spezifität des GRONs liegt in seiner Basensequenz begründet, welche sich

nach der Zielsequenz des Zielgens richtet. Nach Angaben des Antragstellers führt bereits eine

zusätzliche Fehlpaarung zur Herabsetzung der Mutationseffizienz im Zielgen. Die hohe

Spezifität von RTDS wurde in einer Studie mit Tabakpflanzen demonstriert (3).

Beschreibung der zu testenden Rapslinien

Bei den zu testenden Rapslinien handelt es sich um imidazolinon- und

sulfonylharnstoffresistenten Raps. Die Herbizidresistenz basiert auf einer Mutation im

Acetolactatsynthase-Gen. Acetolactatsynthase (ALS) ist ein Schlüsselenzym in der Synthese

der verzweigten Aminosäuren. Das für ALS kodierende Gen (AHAS) ist sowohl im A-Genom

(AHASIIA, AHASIIIA, AHASIVA) als auch im C-Genom (AHASIC, AHASVIC) des Rapses

lokalisiert, wobei nur AHASIIIA und AHASIC konstitutiv exprimiert und für die katalytische

Aktivität des Enzyms essentiell sind (4). Die katalytische Untereinheit der ALS bildet ein Dimer,

welches als Homodimer (Produkt von AHASIC, C+C oder von AHASIIIA, A+A) oder als

Heterodimer (Produkt von AHASIC und AHASIIIA, C+A) vorliegen kann (5). Die Inhibierung

von ALS durch Imidazolinone und/oder Sulfonylharnstoffe führt zum Absterben der Pflanze,

da die Wirkstoffe die Bindungsstelle im katalytischen Zentrum des Enzyms blockieren und

damit die Synthese der verzweigten Aminosäuren verhindern. Mutationen in den katalytischen

Untereinheiten des Gens können jedoch Toleranz gegenüber diesen Wirkstoffen bewirken. So

führt der Austausch von Serin zum Asparagin an der Position 653 (PM1-Mutation) zur

Resistenz gegenüber Imidazolinon, der Austausch von Trypthophan zum Leucin an der

Position 574 (PM2) führt zur Resistenz gegenüber Imidazolinon und Sulfonylharnstoffen. In

der Vergangenheit wurden bereits imidazolinonresistente Rapslinien entwickelt, in welchen die

Mutationen PM1 im Gen AHASIC bzw. PM2 im Gen AHASIIIA z.B. durch chemische

Mutagenese eingeführt wurden (4). Die Firma Cibus hat nun Raps entwickelt, in welchem die

Toleranz gegenüber Imidazolinon und Sulfonylharnstoffen auf der PM2-Mutation sowohl im

Gen AHASIC als auch im Gen AHASIIIA beruht. Diese Mutation wurde mittels RTDS-

Technologie in die AHAS-Gene eingeführt. Die vollständige Sequenzierung der Gene AHASIC

und AHASIIIA und der Vergleich der Sequenzen mit den Sequenzen des Wildtyp-Rapses

zeigten, dass die Mutation ortspezifisch erfolgte und keine Veränderungen in der

Promotorregion oder in anderen Genabschnitten verursachte, die die endogene

Genexpression beeinflussen könnten.

In Feldversuchen verwendet werden sollen Nachkommen aus Kreuzungen, in welchen ein

oder mehrere Kreuzungspartner PM1 und/oder PM2-Mutationen enthalten, die mit der

GRON-Technik erzeugt worden waren.

Bewertung

RTDSTM stellt eine Technologie dar, bei der keine integrativen Vektorensysteme genutzt bzw.

neue Kombinationen des genetischen Materials in das Pflanzengenom integriert werden oder

in der Zelle verbleiben. RTDSTM führt zu ortspezifischen Punktmutationen im Pflanzengenom,

wobei endogene Reparatur- und Regulationsmechanismen genutzt werden. Das bei RTDSTM

eingesetzte Nukleotid GRON ist keine rekombinante Nukleinsäure; seine Eigenschaften wie

Struktur, chemischer Aufbau und kurze Halbwertszeit verhindern dessen Integration in das

Pflanzengenom. Das GenTG und die RL 2001/18/EG und RL 2009/41/EG definieren

rekombinante Nukleinsäure als neukombiniertes genetisches Material. In ihrer Stellungnahme

vom Juni 2012 vertritt ZKBS die Meinung, dass ein Segment mindestens 20 Nukleotidpaare

(NP) umfassen muss, um zu einer rekombinanten Nukleinsäure zu führen. Eine absichtliche

Änderung von weniger als 20 NP kann von dem zufälligen Vorkommen dieser Sequenz nicht

hinreichend sicher unterschieden werden. Bestimmte Sequenzen von weniger als 20 NP

können zwar nachgewiesen werden, eignen sich jedoch nicht zur Bestimmung ihrer Herkunft.

Sie sind nicht von den durch konventionelle Mutagenese oder durch zufällige natürliche

Mutation entstandenen genetischen Veränderungen zu unterscheiden. Bei der RTDSTM-

Technik werden Mutationen in das Pflanzengenom eingeführt, die über 1 oder 2 NP nicht

hinausgehen und damit von der spontanen Mutation nicht zu unterscheiden sind. Die durch

Mutagenese-Verfahren induzierten Mutationen gelten gemäß § 3 Nr. 3b. Satz 2 Buchst. a

GenTG (Mutagenese) nicht als gentechnische Veränderungen.

Die RTDSTM-Mutagenese ist als eine Oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese (OgM)

einzuordnen. In ihrer Stellungnahme vom Juni 2012 bewertete ZKBS die durch die OgM

entstandenen Organismen mit folgenden Begründungen als Organismen, die nicht

gentechnisch verändert sind:

- Die Oligonukleotide, die in die Zellen eingebracht werden, sind keine neuen

Kombinationen genetischen Materials, denn ihre Sequenz richtet sich nach der

Zielsequenz (Watson-Crick-Basenpaarung oder Hoogsteen-Basenpaarung), ggf. mit

einer Abweichung von einem oder wenigen Nukleotiden.

Bei den eingebrachten Oligonukleotiden handelt es sich nicht um rekombinante

Nukleinsäuren gemäß § 3 Nr. 3a. Buchst. a GenTG. Die gleiche Bewertung ergibt sich

gemäß Anhang I A Teil 1 Nr. 1 RL 2001/18/EG bzw. Anhang I Teil A Nr. 1 RL

2009/41/EG.

- Die Oligonukleotide, einschließlich der chemisch veränderten Nukleinsäuren und

Derivate, sind gemäß § 3 Nr. 3a. Buchst. b GenTG kein genetisches Material oder

Erbgut. Die gleiche Bewertung ergibt sich gemäß Anhang I A Teil 1 Nr. 2 RL

2001/18/EG bzw. Anhang I Teil A Nr. 2 RL 2009/41/EG.

- Die Oligonukleotide wirken wie Mutagene und rufen Mutationen von einem oder

wenigen Nukleotidpaaren hervor, wie sie gleichermaßen auch spontan oder nach

Anwendung von Mutagenen auftreten können und sind damit nicht von spontanen

Mutationen oder von Mutationen, die durch Mutagenese hervorgerufen werden,

unterscheidbar. Durch Mutagene erzeugte genetische Varianten sind gemäß § 3 Nr.

3b. Satz 2 Buchst. a GenTG (Mutagenese) keine GVO. Die gleiche Bewertung ergibt

sich gemäß Anhang I B Nr. 1 RL 2001/18/EG bzw. Anhang II Teil A Nr. 1 RL

2009/41/EG.

Unter Berücksichtigung der aktuellen Rechtsgrundlage und der vorgelegten Daten kommt die

ZKBS daher zum Schluss, dass die durch die RTDSTM-Technologie entwickelten Rapslinien

nicht als GVO zu bewerten sind.

Berlin, den 3. Februar 2015

Prof. Dr. Pfister

Vorsitzender der ZKBS